|
|
Structure-assisted design of inhibitors targeting medicinally relevant enzymes
Djukic, Stefan ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Kutá-Smatanová, Ivana (oponent) ; Kolenko, Petr (oponent)
Racionální návrh léčiv je moderní efektivní přístup, využívající detailní znalosti trojrozměrné struktury k návrhu a optimalizaci nových inhibitorů cílících na klinicky relevantní enzymy. Metodou strukturní biologie, hojně využívanou v racionálním návrhu léčiv, je rentgenová krystalografie. Její silnou stránkou je schopnost poskytnout detailní obraz komplexu protein-inhibitor s rozlišením umožňujícím analýzu jednotlivých interakcí mezi inhibitorem a proteinem.PNP hraje klíčovou roli v metabolické dráze záchrany purinových nukleotidů, a je tak zajímavým terapeutickým cílem nejen pro léčbu T buněčných hematologických malignit, ale i parazitických infekcí. V našich studiích jsme se zaměřili na lidskou PNP a její ortholog v M. tuberculosis s cílem vyvinout nové inhibitory s vysokou specificitou a selektivitou pro každý z enzymů. Prezentované inhibitory patří do skupiny acyklických nukleosid fosfátů s 9-deazahypoxanthinovou nukleobází, obsahující tři funkční skupiny, které se vážou na všechna tři důležitá rozhraní aktivního místa: purin, fenyl a fosfonátovou skupinu. Nejlepší z inhibitorů dosáhly hodnot IC50 až 19 nM a 4 nM pro lidskou, respektive mykobakteriální PNP. Zavedení malých substituentů, jako například methoxy- nebo bromo- skupiny, na centrální fenylový kruh vedlo ke snížení afinity inhibitoru...
|
|
|
Strukturní a funkční studie MICAL signalizace v dynamice cytoskeletu
Rožová, Dominika ; Rozbeský, Daniel (vedoucí práce) ; Sulimenko, Vadym (oponent)
Předmětem této práce byl kuřecí protein MICAL1, který se zapojuje do semaforin- plexin signální dráhy a má významný vliv na přeskupování cytoskeletu. Význačná role MICAL1 proteinu je spojována především s naváděním axonů, jelikož destabilizuje aktinová filamenta prostřednictvím své oxidační aktivity. Zaměřili jsme se na objasnění molekulárních mechanismů autoinhibice kuřecího MICAL1 za pomoci metod molekulární a strukturní biologie společně s novými metodami predikce proteinových struktur. Kuřecí MICAL1 byl vyroben v hmyzích buňkách Sf9 bakulovirovým expresním systémem, přičemž byla vyprodukována jak plná, tak zkrácená verze kuřecího proteinu MICAL1. Proteiny jsme charakterizovali kineticky a určili oligomerní stav kuřecího MICAL1 v roztoku. Velké úsilí jsme věnovali rozřešení proteinové struktury pomocí krystalografie, elektronové mikroskopie a predikce v programu Alphafold 2. Na základě výsledků těchto metod jsme vyvodili, že MICAL1 proteiny jsou regulovány skrze svou C terminální doménu, která interaguje s monooxygenázovou doménou. V rámci této interakce tak dojde k autoinhibici kuřecího MICAL1. Vyloučili jsme možnost, že by kuřecí MICAL1 byl regulován změnou svého oligomerního stavu. Výsledky této diplomové práce budou sloužit pro další studium interakce MICAL1 v rámci navazujících diplomových...
|
|
|
Regulace metabolismu purinových nukleotidů jako farmakologický cíl
Brinsa, Vítězslav ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Purinové nukleotidy tvoří základní stavební kameny DNA a RNA. Jsou nepostradatelnou součástí struktury některých kofaktorů, podílejí se na přenosu a skladování energie, buněčné signalizaci a regulaci biochemických procesů v buňce. Pro správnou funkci, přežití a dělení buněk je naprosto nezbytné, aby měly neustále dostatečnou zásobu nukleotidů. Hladina purinových nukleotidů je v lidském těle regulována prostřednictvím jejich metabolismu, jenž sestává ze tří koordinovaných procesů. Těmi jsou de novo syntéza, resyntéza a degradace. Regulace těchto procesů je řízena na různých buněčných úrovních od regulace genové exprese zapojených enzymů, jejich allosterické regulace až po utváření multienzymových komplexů v de novo syntéze - tzv. purinosomů. Důležitou složkou metabolismu purinových nukleotidů jsou fosforibosylpyrofosfát synthetasa I (PRS-I) a cytosolická purinová 5'-nukleotidasa (cN-II). Tyto enzymy se významně podílejí na regulaci hladiny purinů prostřednictvím jejich allostericky regulované aktivity. Poruchy aktivity těchto enzymů jsou spojeny různými onemocněními včetně dny, tvorby ledvinových kamenů, neurologických dysfunkcí či akutní lymfoblastické leukemie (ALL). Mutantní varianta cN-II nesoucí mutaci R238W způsobuje relaps ALL. Cílem experimentální části této práce byla příprava a...
|
|
|
Studium struktury transkripčních faktorů regulujících metabolismus pankreatických beta buněk
Duchoslav, Vojtěch ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Nkx6.1 je homeodoménový protein o velikosti 37,8 kDa a důležitý transkripční faktor regulující transkripci významných genů beta pankreatických buněk. Nedostatečná exprese tohoto proteinu vede k porušené transkripci glukozového přenašeče Glut2, jejímž důsledkem je snížené vychytávání glukózy z krve a narušení celého metabolismu glukózy. Dále je potlačena proliferace beta pankreatických buněk kvůli nízké transkripci mitogenu cyclin D2 spouštějícího mitotické dělení buněk. V neposlední řadě se vážně naruší biosyntéza inzulinu špatnou transkripcí genů pro proteiny Ero1lb a Slc30a8, což vede k poklesu jeho produkce. Nkx6.1 hraje roli v patogenezi cukrovky druhého typu. Při tomto onemocnění vykazují beta buňky zmenšenou schopnost kompenzovat zvýšený požadavek na produkci inzulinu. Důvodem je nízká sekrece inzulinu a smrt beta pankreatických buněk. Jedna z možných příčin muže být špatná regulace transkripce genů, účastnících se zmíněných procesů. Nkx6.1 rozeznává vysoce konzervovanou oligonukleotidovou sekvenci DNA (TTAATTAC). Vazba k DNA je navíc regulována doménou se zvýšeným výskytem kyselých aminokyselinových zbytků na karboxylovém konci molekuly. V rámci bakalářské práce byly přiřazeny rezonance atomů hlavního řetězce proteinu Nkx6.1 pomocí metody nukleární magnetické rezonance (NMR). K tomuto účelu...
|
|
|
Biofyzikální charakterizace proteinového komplexu CAR/RXR s jeho vazebnými partnery
Duchoslav, Vojtěch ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Konstitutivní androstanový receptor (CAR) hraje v organismu významnou roli xenosenzoru, a proto je hojně exprimován v ledvinách, játrech, žlučníku a v epitelu tenkého střeva, kde dochází k biotransformaci xenobiotik. CAR je také důležitým faktorem pro eliminaci žlučových kyselin a bilirubinu. Taktéž se ukázalo, že CAR má významnou roli v regulaci metabolismu glukózy a lipidů. Narušení metabolismu tuků a glukózy je častou příčinou kardiovaskulárních a metabolických onemocnění, jako jsou ateroskleróza, cukrovka druhého typu, obezita a inzulínová rezistence. Tento stav nazýváme metabolickým syndromem a mívá za následek vážné poškození orgánů. Díky schopnosti ovlivňovat metabolismus se CAR, respektive jeho komplex s RXRα (retinoidní X receptor α), stal slibným biologickým cílem pro výzkum potenciálních léčiv metabolického syndromu. Cílem této diplomové práce byla především strukturní charakterizace proteinového komplexu CAR/RXRα spolu s agonistou IV676*HCl, která by detailně popsala interakci této malé molekuly s receptorem. Získané strukturní informace by byly využity při návrhu nových agonistů.
|
|
|
Binding of eIF3 in complex with eIF5 and eIF1 to the 40S ribosomal subunit is accompanied by dramatic structural changes
Zeman, Jakub
Eukaryotické iniciační faktory (eIF) jsou pro průběh eukaryotické translace minimálně stejně důležité jako ribosom. Některé tyto faktory mají rozdílné úlohy napříč celou translací v zajištění korektního složení preiniciačního komplexu na mRNA, přesném výběru iniciačního kodonu, bezchybné produkci příslušného polypeptidu a jejím řádném ukončení. Patrně nejdůležitějším z těchto faktorů je eIF3, který integruje signály od ostatních faktorů a koordinuje jejich funkci na ribosomu. V případě Saccharomyces cerevisiae je eIF3 tvořen pěti podjednotkami. Všechny tyto podjednotky obsahují strukturní motivy zodpovědné za kontakt s ribosomálními proteiny a molekulami RNA. Kromě těchto vysoce strukturovaných částí je zbytek eIF3 nestrukturovaný a velmi flexibilní. Z toho důvodu nejsou i přes současný pokrok v kryoelektronové mikroskopii doposud známy ani přesná struktura eIF3, ani jeho přesná poloha na ribosomální podjednotce 40S. Rovněž přítomnost eIF3 na ribosomu 80S během časné elongace a role eIF3 v reiniciaci a pročítání stop kodonu nejsou zatím zcela prostudovány. K rozluštění těchto tajemství eIF3 jsme použili rentgenovou krystalografii, chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií a rozličné biochemické a genetické metody. Naše práce ukazuje, že je eIF3 velmi kompaktně sbalený, pokud se nachází...
|
|
|
Binding of eIF3 in complex with eIF5 and eIF1 to the 40S ribosomal subunit is accompanied by dramatic structural changes
Zeman, Jakub
Eukaryotické iniciační faktory (eIF) jsou pro průběh eukaryotické translace minimálně stejně důležité jako ribosom. Některé tyto faktory mají rozdílné úlohy napříč celou translací v zajištění korektního složení preiniciačního komplexu na mRNA, přesném výběru iniciačního kodonu, bezchybné produkci příslušného polypeptidu a jejím řádném ukončení. Patrně nejdůležitějším z těchto faktorů je eIF3, který integruje signály od ostatních faktorů a koordinuje jejich funkci na ribosomu. V případě Saccharomyces cerevisiae je eIF3 tvořen pěti podjednotkami. Všechny tyto podjednotky obsahují strukturní motivy zodpovědné za kontakt s ribosomálními proteiny a molekulami RNA. Kromě těchto vysoce strukturovaných částí je zbytek eIF3 nestrukturovaný a velmi flexibilní. Z toho důvodu nejsou i přes současný pokrok v kryoelektronové mikroskopii doposud známy ani přesná struktura eIF3, ani jeho přesná poloha na ribosomální podjednotce 40S. Rovněž přítomnost eIF3 na ribosomu 80S během časné elongace a role eIF3 v reiniciaci a pročítání stop kodonu nejsou zatím zcela prostudovány. K rozluštění těchto tajemství eIF3 jsme použili rentgenovou krystalografii, chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií a rozličné biochemické a genetické metody. Naše práce ukazuje, že je eIF3 velmi kompaktně sbalený, pokud se nachází...
|
|
|
Binding of eIF3 in complex with eIF5 and eIF1 to the 40S ribosomal subunit is accompanied by dramatic structural changes
Zeman, Jakub ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Štefl, Richard (oponent) ; Man, Petr (oponent)
Eukaryotické iniciační faktory (eIF) jsou pro průběh eukaryotické translace minimálně stejně důležité jako ribosom. Některé tyto faktory mají rozdílné úlohy napříč celou translací v zajištění korektního složení preiniciačního komplexu na mRNA, přesném výběru iniciačního kodonu, bezchybné produkci příslušného polypeptidu a jejím řádném ukončení. Patrně nejdůležitějším z těchto faktorů je eIF3, který integruje signály od ostatních faktorů a koordinuje jejich funkci na ribosomu. V případě Saccharomyces cerevisiae je eIF3 tvořen pěti podjednotkami. Všechny tyto podjednotky obsahují strukturní motivy zodpovědné za kontakt s ribosomálními proteiny a molekulami RNA. Kromě těchto vysoce strukturovaných částí je zbytek eIF3 nestrukturovaný a velmi flexibilní. Z toho důvodu nejsou i přes současný pokrok v kryoelektronové mikroskopii doposud známy ani přesná struktura eIF3, ani jeho přesná poloha na ribosomální podjednotce 40S. Rovněž přítomnost eIF3 na ribosomu 80S během časné elongace a role eIF3 v reiniciaci a pročítání stop kodonu nejsou zatím zcela prostudovány. K rozluštění těchto tajemství eIF3 jsme použili rentgenovou krystalografii, chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií a rozličné biochemické a genetické metody. Naše práce ukazuje, že je eIF3 velmi kompaktně sbalený, pokud se nachází...
|
|
|
Studium struktury transkripčních faktorů regulujících metabolismus pankreatických beta buněk
Duchoslav, Vojtěch ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Nkx6.1 je homeodoménový protein o velikosti 37,8 kDa a důležitý transkripční faktor regulující transkripci významných genů beta pankreatických buněk. Nedostatečná exprese tohoto proteinu vede k porušené transkripci glukozového přenašeče Glut2, jejímž důsledkem je snížené vychytávání glukózy z krve a narušení celého metabolismu glukózy. Dále je potlačena proliferace beta pankreatických buněk kvůli nízké transkripci mitogenu cyclin D2 spouštějícího mitotické dělení buněk. V neposlední řadě se vážně naruší biosyntéza inzulinu špatnou transkripcí genů pro proteiny Ero1lb a Slc30a8, což vede k poklesu jeho produkce. Nkx6.1 hraje roli v patogenezi cukrovky druhého typu. Při tomto onemocnění vykazují beta buňky zmenšenou schopnost kompenzovat zvýšený požadavek na produkci inzulinu. Důvodem je nízká sekrece inzulinu a smrt beta pankreatických buněk. Jedna z možných příčin muže být špatná regulace transkripce genů, účastnících se zmíněných procesů. Nkx6.1 rozeznává vysoce konzervovanou oligonukleotidovou sekvenci DNA (TTAATTAC). Vazba k DNA je navíc regulována doménou se zvýšeným výskytem kyselých aminokyselinových zbytků na karboxylovém konci molekuly. V rámci bakalářské práce byly přiřazeny rezonance atomů hlavního řetězce proteinu Nkx6.1 pomocí metody nukleární magnetické rezonance (NMR). K tomuto účelu...
|
|
|
Regulace metabolismu purinových nukleotidů jako farmakologický cíl
Brinsa, Vítězslav ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Purinové nukleotidy tvoří základní stavební kameny DNA a RNA. Jsou nepostradatelnou součástí struktury některých kofaktorů, podílejí se na přenosu a skladování energie, buněčné signalizaci a regulaci biochemických procesů v buňce. Pro správnou funkci, přežití a dělení buněk je naprosto nezbytné, aby měly neustále dostatečnou zásobu nukleotidů. Hladina purinových nukleotidů je v lidském těle regulována prostřednictvím jejich metabolismu, jenž sestává ze tří koordinovaných procesů. Těmi jsou de novo syntéza, resyntéza a degradace. Regulace těchto procesů je řízena na různých buněčných úrovních od regulace genové exprese zapojených enzymů, jejich allosterické regulace až po utváření multienzymových komplexů v de novo syntéze - tzv. purinosomů. Důležitou složkou metabolismu purinových nukleotidů jsou fosforibosylpyrofosfát synthetasa I (PRS-I) a cytosolická purinová 5'-nukleotidasa (cN-II). Tyto enzymy se významně podílejí na regulaci hladiny purinů prostřednictvím jejich allostericky regulované aktivity. Poruchy aktivity těchto enzymů jsou spojeny různými onemocněními včetně dny, tvorby ledvinových kamenů, neurologických dysfunkcí či akutní lymfoblastické leukemie (ALL). Mutantní varianta cN-II nesoucí mutaci R238W způsobuje relaps ALL. Cílem experimentální části této práce byla příprava a...
|
host ::
RSS.